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發信人: trey (蘭萱)    看板: medicine
日期: Sat Jun 19 14:56:25 1999
標題: 標準組織免疫染色步驟

 作者  level.bbs@bbs.life.nthu.edu.tw (轟陪機小姐),         看板  Medicine    
 標題  標準組織免疫染色步驟                                                   
 時間  清華生命科學 BBS (Fri May 14 11:55:37 1999)                            
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標準組織免疫染色步驟

從冰箱中拿出冷凍slide,讓其回溫至室溫,用SecurelineR   pen 標示所有
slide, 並置於PBS中,再利用2-3x PBS潤溼slide, 去除冰凍 mounting media
(SecurelineR  pen 在脫水及清洗 slide 不會掉色)

拭去在樣本周圍過多的buffer

加100ul已經稀釋好濃度的一次抗體至slide上,在室溫下培養一小時 ﹙抗體的
量依組織的大小而定)

利用 PBS 潤溼 slide 三次,每次二分鐘

擦拭 slide, 接著加入100ul已稀釋濃度的生物素結合二次抗體﹙必須能與 speice
或一次抗體 isotype 相互 match )。在室溫下培養卅分鐘。

利用 PBS 溼潤 slide 三次,每次二分鐘。

擦拭 slide, 接著加入100ul Strepavidin/HRP 到每個 slide, 在室溫下培養卅分鐘

利用 PBS溼潤 slide三次,每次二分鐘。

根據操作說明書置備 DAB ﹙DAB是種 carcinogen, 操作時須小心,最好戴手套)

小心的滴掉 slide 液體並將 slide 置於平面,如果使用 SeguenzaR  rack, 去除
coverplates, 將 slide 置於平面﹙不要讓 slide 乾掉)

每個 slide 加入大約 400ul DAB溶液,確定所有組織都覆蓋溶液,在 humid chamber
 培養五分鐘左右。

小心的拿起每片 slide , 在紙巾上滴掉多餘 DAB,置於染色架上放入大水盤中。

用清水潤濕 slide 三次

Counterstain slide:
a. 浸泡一下 Gill 1 Hematoxylin 2 次
b. 用清水潤濕
c. 浸泡一下 Bluing Reagent或稀釋氨水, 二次
d. 用清水潤濕
用100%酒精進行脫水四次,再用 xylene 清潔 slide 3~4 次,蓋上蓋玻片,讓所有
slides 滴約 15-20 秒

注意事項:

內因性 peroxidase 阻斷,可以被使用在 1,2 步驟(0.3 % H2O2 in PBS 10 分鐘)
勿使用 methanol 在冰凍切片上做 blocking

如果使用 SequenzaR   架子,則先放置 slide ,直到要加一次抗體,這些 slide
不需要再被處理,直到使用 chromagen

我們稀釋所有買來的一次抗體及二次抗體,如果不稀釋的話,在 5% 正常的 PBS培養
切片,來阻斷非特異性鍵結(二次抗體若是 goat anti-mouse 的話,則用 5%normal
 goat serum 來 block)培養10-30分鐘,在加入一次抗體之前。在這之後不須潤濕
(如果使用 humid chambers, 拍掉 blocking solution, 直接進行一次抗體應用

如果使用 chromagen, 在酒精中不穩定,蓋上蓋玻片時加水溶性的 mounting media,
並且不進行脫水及清潔 slides

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    雨絲....
         斜斜地,斜斜地織成淡得記憶
          而是否淡的記憶  就永留於星斗之間呢

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* Origin: 國立中山大學 Formosa BBS-美麗之島 * From: 140.117.11.3 [已通過認證]


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